PCR扩增出来几条带,怎么改进

显示全部楼层 · 2010-8-7 15:59:41

我扩增的是霉菌18rDNA,大小是1600，PCR体系是50的，条件是94,3min;94,1min;55,1min,72,1min,72,10min.30个循环，按道理来说，电泳后应该只有一条带，但我的有四条带，有三条在1000--2000之间，且靠的很近，另一条比2000大，这是怎么回事啊？要怎样改进啊？

千问 · 2010-8-7 15:59:41

两方面考虑：1 改善PCR反应条件，从你提供的情况看，55度退火太低。建议做个温度梯度PCR，在55度到67度间，每升高2度,做一个反应。另建议将反应体系设为20微升（温度升降过程易于达到目标值）。2. 如果通过改变退火温度，仍然达不到想要效果，考虑模板是否合适；此外，建议对引物重新设计，适当增长引物长度，改变引物位置。考虑到了上述因素，一般来说，没道理做不出一条带的。

千问 · 2010-8-7 15:59:41

你的72度延伸时间太短啦，PCR的延伸速度是一分钟1kb，你的目的片段是1600，至少延伸时间要达到1分钟40十多秒啊，一分钟是肯定不可能完成你想要的1600bp的目的片段的！你那些大小不等的片段有可能是扩增到半截的片段。还有55度退火不用那么长时间，一般30、40秒足以。