关于原核表达基因测序问题

显示全部楼层 · 2011-6-13 22:59:18

原核表达基因克隆时，为什么非要先克隆到中间载体上测序，而不是直接到表达载体，拿表达载体测序呢？希望大侠们不吝赐教啊！

千问 · 2011-6-13 22:59:18

其实简单一点，可以直接克隆到表达载体上，送去测序确定之后再表达；我们以前一直这么做的；但是有些情况下，比如表达载体不是诱导型的，或者表达的蛋白对大肠杆菌宿主菌毒性很大，影响菌的生长，导致菌生长困难、提质粒困难等等，就会先克隆到一个克隆载体上面，做测序确定；然后再克隆到表达载体上。通常来说我不太喜欢做两次克隆，总是酶切转化筛选；我喜欢选控制比较严谨的可调控性原核表达载体，比如pET系列的多个载体，直接把目的基因克隆上去。...

千问 · 2011-6-13 22:59:18

如果该基因表达不影响表达载体的生长，是可以一步直接转入表达载体的。但是表达载体不宜作为质粒长期保存载体。...

千问 · 2011-6-13 22:59:18

每一步都是在确定你的基因是否正确。简单地说，如果你最后没有表达，问题出在哪一步就很难确定，只有在前面每一步都确定后，才不用最后走弯路。...