elisa检测方案

显示全部楼层 · 2009-6-6 11:35:50

需要在论文末尾添加elisa检测。
以前没做过elisa，搜了点资料
做出的这个设计，大家看有没有问题。
我做的是磷酸化抗体提纯
最后要证明这个抗体只能与其相对应的磷酸化蛋白反应。
双抗体夹心法：
1）将该磷酸化抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。
4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
为证明抗体只能与其相对应的磷酸化蛋白反应
我是不是应该
先后用该抗体对应的磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白
先后与固相抗体接触
以两个最后OD值的不同来说明问题？
应该是哪个高？
酶标抗体和底物用什么比较好？
酶标抗体和固相抗体都用磷酸化抗体？

千问 · 2009-6-6 11:35:50

不是先后结合。你应该设立两组，即一组固相抗体加磷酸化抗原，然后另一组固相抗体加非磷酸化抗原。然后显色后对比两组的OD差异。加磷酸化抗体的组的OD当然高了。酶标抗体是抗你的磷酸化蛋白的抗体啊，这个是要你自制的。底物你用最普通的就行了，比如OPD、TMB等都行。我建议你的酶标抗体用磷酸化抗体，而固化抗体最好不用磷酸化抗体，尤其是你的磷酸化蛋白只有1个磷酸化位点的时候。因为固相抗体和酶标抗体有可能去竞争结合磷酸化位点。...