最近做了连接转化，挑平板上的菌落摇菌后提质粒，单酶切可以切开，而且质粒的大小明显小于空质粒

显示全部楼层 · 2011-2-23 14:03:26

“单酶切可以切开，而且质粒的大小明显小于空质粒”，首先你的表达有误，单酶切可以切开，说明目的基因有连接上，那么重组载体该是比空载大的。质粒稀释100倍后PCR，有目的条带，也说明了是阳性克隆。有拖带，你可以把退火温度提高试试。后面上样9ul目的条带很浅，应该是你稀释倍数太高了。我一般是不稀释的，直接PCR，不过得看你提取质粒时加多少体积的水溶。我觉得不需要另外转入空载，PMD18-T vector的连接率挺高的。只要挑取阳性克隆抽质粒，经酶切、PCR后有目的条带就可以拿去测序了。如果PMD18-T vector只作为中间载体，可亚克隆到其他载体...

千问 · 2011-2-23 14:03:26

转入空载质粒、含有插入的DNA片段、以及少量具有抗性的菌落在选择培养基上受到的选择压不同，生长速率不一致。...

千问 · 2011-2-23 14:03:26

T载体转化不难做的，先B-W筛选，再做菌液PCR，然后提质粒做双酶切鉴定。...