2007年5月7日上映,片中将出现三个反派人物.沙魔,毒液和绿魔二代.第一个出场反派是绿魔二代,第三集紧接第二集最后镜头,蜘蛛侠帕克的好友哈利发现了父亲留下的绿魔装备后决定为父报仇.但在于帕克打斗中受伤被蜘蛛侠送往医院,与此同时,来自陨石的一种神秘力量进入蜘蛛侠的红蓝衣服,变成黑色.蜘蛛侠3大部分时间帕克都将身穿黑色蜘蛛服,包括与第二个出场的沙魔的战斗.在教堂顶帕克借助钟声把黑色蜘蛛服撕下,黑色蜘蛛服被钟下经过的帕克的大学教授得到.即为该片第三个反派,毒液.毒液身穿黑色蜘蛛服,外形与蜘蛛侠一样,但体型较大.最后毒液与沙魔联合在一处建筑工地搏斗,后来绿魔二代也加入战斗,不过他帮的是蜘蛛侠.最后结果该片死去的主角有帕克的姨妈梅姨,哈利(绿魔二代).以上观点来源于索尼哥伦比亚公司内部泄露的该片部分情节.
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