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一、前言自由基是需氧生物生命活动过程中多种生化反应的中间代谢产物,是机体有效的防御系统,但当其产生过多或清除过慢时,便会通过攻击生命大分子物质及各种细胞器官而造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤,加速机体的衰老进程并诱发包括肿瘤在内的多种疾病。自由基清除剂是一类能够清除机体中过多自由基的活性物质,超氧化物歧化酶(SOD) 是其中较为重要的一种。SOD 广泛存在于动物、植物及微生物中,是超氧阴离子自由基(O) 为底物的一种金属酶,其催化的反应如下:O -2 ·+ O-2 ·2H+ SODH2O2 + O2即SOD 能催化O -2 ·歧化,并由此得名。由于SOD能够清除O -2 ,所以在防御氧的毒性、抗辐射损伤以及预防衰老等方面起着重要作用,已作为一种生化新药在临床上广泛使用,并且作为一种生物活性成份广泛应用于保健食品、化妆品和牙膏等日化产品中。目前所用SOD 产品均为从人血或动物血液中提取,但随着国际上疯牛病、口啼疫等传染性疾病的漫延,动物血液中提取的SOD 的使用给人们带来了不少的危险因素。从植物,特别是人们日常食用的无污染蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD ,如大蒜、沙棘果、刺梨、余甘子、五味子、花粉、小白菜及其它果蔬以及绿豆、玉米等粮食中含有丰富的SOD ,资源丰富,使用安全性非常高,避免了可能发生的交叉感染,且成本低廉。SOD 是一种生化新药,能治疗由自由基引发的疾病,目前国内外的临床应用主要集中在自身免疫性疾病和抗辐射上,且应用范围正在扩大。已开展的临术应用主要在:炎症、辐射损伤、家庭性肌萎缩性侧硬化、关节痛、自身免疫性疾病、缺血再灌注综合症、氧中毒、肿瘤的放疗与化疗、老年性白内障、烧伤及多种皮肤病等。作为一种有益的活性成份,SOD 已成为多种保健食品、化妆品和牙膏等日化产品的功效因子或添加剂,其生理功能的基础同样是清除过量的O -2 ·,可以概括为: ①抗衰老,包括皮肤的抗皱与去斑; ②提高机体对多种疾病的抵抗力; ③增强机体对外界环境的适应力; ④减轻肿瘤患者在放疗、化疗过程中的严重毒副作用。二、超氧化物歧化酶的制备工艺超氧化物歧化酶的制备工艺是依据酶蛋白质的性质而设计的,其方法也是常用的蛋白质分离方法,如热变性法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、层析法等,或者几种方法的结合作用。(一) 沉淀法制备超氧化物歧化酶1 、原理SOD 是一种热稳定性较好的酶,当温度低于80 ℃,短时间的热处理酶活力损失不大,而一般杂蛋白却在高于55 ℃易变性沉淀。也可根据酶蛋白在等电点时,溶液中的静电荷为零,酶蛋白的溶解度最小而沉淀下来。或者在超氧化物歧化酶粗酶溶液中加入一些弱极性有机溶剂如丙酮,改变了溶液的介电常数,可使不同种类的蛋白质的溶解度产生不同程度的下降。因此,利用上述方法可以把超氧化物歧化酶和其他杂蛋白分开。2 、化学试剂邻苯三酚、磷酸氢二钾、硫酸铜、酒石酸钾钠、丙酮、标准蛋白(牛血清蛋白) 。3 、设备恒温水浴锅、PH 数字酸度计、调整冷冻离心机、冰箱、透析袋、冷冻干燥机等。4 、工艺流程不同原料,其工艺步骤和条件有所不同,基本流程如下:原料→清洗→破碎→浸提→热变性→高速冷冻离心→调整PH →高速冷冻离心→加丙酮沉淀→高速冷冻离心→溶解沉淀→透析→冷冻干燥→成品5 、工艺说明(以大蒜SOD 的制备工艺为例)(1) 粗酶液制备:将大蒜与PH7. 8 %C |
