做重组质粒时，转化提质粒后PCR验证为阳性，但是酶切却切不出来！

显示全部楼层 · 2012-10-18 22:53:16

PCR非常灵敏，你做连接的时候连接产物就是目的片段和载体，转化的时候连接产物混到感受态细胞里，涂板的时候，那些没连接进去的目的片段DNA则存在于你的平板上，菌落上自然也有，而挑菌落的时候则把把这些DNA带到了试管或者三角瓶里，提质粒的时候它们因为很短，自然不会被蛋白质细胞器基因组DNA沉淀带走，最后和阴性质粒一起再接受PCR，所以出了假阳性。这也是为什么菌落PCR的假阳性远远高于菌液PCR的原因，一般菌液PCR不容易遇到假阳性的，尤其做了蓝白筛选或者用了带有致死基因的克隆载体，不过送去测序之前都最好经过酶切确认。...

千问 · 2012-10-18 22:53:16

你可以送去测序看看
如果测序结果证明你的质粒对的话，可以更换酶切体系（质粒最好浓多点）、时间、如果还不行，就重新买内切酶试试吧
我当初就是切不出来后换了体系，延长时间（过夜最佳）就有了，比较淡而已...

千问 · 2012-10-18 22:53:16

pcr验证时常呈假阳性，以酶切验证为准。或者你可以送去测序。...

千问 · 2012-10-18 22:53:16

酶切体系是否合理，酶切时间是否足够...