Re:问师兄师姐一个跑蛋白胶的问题

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0 | 2021-1-29 02:53:12 | 显示全部楼层 |阅读模式

菌体里也应该有蛋白阿，rosseta典型的三条膜蛋白,bl21de3把那三个蛋白突变掉了干得好！哦也当然还有其他条带的，理论上应该是从上到下10多条带，嘿嘿，没具体数过。
我觉得是你样品处理问题加水加loadingbuffer后，你混匀了么？而且一毫升菌太多了，煮完了也是粘粘的一团，你根本吸不上来，所以加到样品槽里的可能都是buffer
1:50扩2hr太短了，诱导以后表达外源蛋白会影响菌的生长；诱导前菌量少的话表达量必然也很少。你看看novagen(大概是这个吧，还是inovagen?)pET质粒的mannual,里面推荐的是1：10扩培：）
100度10min，不推荐要蛋白质变形也不能这么虐待人家阿，就跟煮鸡蛋一样。蛋白样品如果不可容跑电泳就会严重拖尾，熟鸡蛋不溶于水吧。
我喜欢室温放置1天（如果你也很懒的话）也可以80度5min,然后快速离心一下，把熟鸡蛋一样的不容物质沉下去……
以上内容节选自《cyan讲电泳》高级生化实验教材分册预购从速阿angelxq (空谷) 在 ta 的帖子中提到：我做了一个分子亚克隆，把质粒转到表达菌以后，摇菌过夜，然后1：50扩培2小时15分，再取出1毫升作负对照，剩下的用IPTG诱导4小时。最后各取1毫升，离心将菌溶于dd水，加LoadingBuffer100度加热10分钟，跑蛋白胶。结果染色，脱色之后除了marker有以外，样品一点没有，包括负对照也没有，干净得象没跑过一样。。。。。。有没有师兄师姐知道为什么。我确实看到有菌存在的，再怎么样为什么一点儿蛋白都没有呢？狂郁闷。

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