司徒横
医师
漳州市盛安医院
擅长：全科
提问
DNA提取试剂盒是根据氯化芐法构建的，能够从样本中提取基因组DNA的试剂盒。氯化苄具有能将含有纤维素等的细胞壁中的羟基苄基化，从而破坏细胞壁的特性。本制品利用了氯化苄的这一特性，将植物样品冻结融解后，再使用Pipet Tip的尖端将植物样品在Microtube壁上数次按压即可破坏细胞壁。本法与传统方法相比，省去了液氮研磨等烦琐步骤，有利于一次性处理大量样品。而且，本制品经过了改良，热处理时间只需15分钟，使用本制品从实验开始至水相回收只需30分钟时间。得到的基因组DNA可以进行PCR扩增及限制酶处理等。2保存方式编辑室温。低温保存可能会有沉淀析出。如果发生析出现象，请于50℃溶解后，再于室温保存。3操作方法编辑全套操作约需1小时，分匀浆、细胞裂解、除蛋白、DNA纯化等步骤，详细说明如下。匀浆和细胞裂解:使用不同的实验材料需采用不同的匀浆步骤，具体说明如下：【从动物组织中提取基因组DNA】使用研钵进行匀浆时：① 取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中，快速用力展研成匀浆。注）下列组织请加液氮研磨至粉末状。A．富含DNA酶的胰脏、脾脏、胸腺、淋巴等组织。B．富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。C．富含角质蛋白的组织或坚硬的组织（如骨骼）等。② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1，温和研磨30秒钟。注）使用上述①-注）的实验材料时，请在加入Solution A及RNase A1后，将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟。③ 收集650 μl研磨好的组织匀浆液移至Collection Tube中。如果匀浆体积不足650 μl，请补充Solution A至650 μl，65℃保温5分钟。使用研磨棒进行匀浆时:① 取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的Collection Tube 中，用研磨棒快速研磨成糊状。② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成匀浆。③ 加入350 μl的Solution A将研磨棒上的匀浆冲入Collection Tube中，充分振荡混合后，65℃保温5分钟。【从植物材料或植物培养细胞中提取基因组DNA】① 按下表称取适量的新鲜植物材料（如选用的是冷冻干燥植物材料，则用量减半），剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。植物材料种类植物材料使用量*植物花、叶片10～100 mg植物茎60～240 mg植物根80～240 mg植物种子80～240 mg* 如选取植物的根、种子等样品时，因其基因组DNA含量很低，需使用超过表格中所示的参数用量，此时请分两管进行步骤1～6的实验操作，在步骤7的操作中再将各管溶液分次加入至同一Spin Column中过滤，使各管的基因组DNA结合到同一个Spin Column上。如从培养的植物细胞中提取基因组DNA，请离心收集2×103～1×107的培养植物细胞，加入150 μl水充分悬浮细胞后移入研钵中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末状。注）样品研磨应充分，否则将会严重影响基因组DNA的收率。② 将研钵移至65℃水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1，用力碾磨30秒。③ 收集650 μl研磨好的组织匀浆移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650 μl，请补充Solution A至650 μl。65℃保温15分钟。注）处理富含纤维的根/茎等植物材料或富含淀粉、蛋白质的种子等时，可延长水浴时间至60分钟。【从全血中提取基因组DNA】① 取10～250 μl的全血（含抗凝剂）加入至Collection Tube中。② 加入500 μl的Solution A。③ 加入1 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟后，冰浴5分钟。注） 人与动物的抗凝全血的一次处理量为≤250 μl；禽类、两栖类的抗凝全血的一次处理量为≤10 μl。【从培养细胞中提取基因组DNA】三.使用悬浮培养的动物细胞时：① 使用Collection Tube收集1×105～1.5×107的细胞悬浮液，5,000 rpm离心5分钟，弃上清（细胞培养液）。② 加入150 μl的灭菌蒸馏水或PBS悬浮细胞。③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。四.使用贴壁细胞时：① 弃尽培养液，向培养皿中加入650 μl的Solution A，室温静置1分钟。注）96孔板等的每个孔中一次容纳不了650 μl 溶液时，请分数次处理细胞。② 用移液枪的枪头吹落贴壁培养细胞，取650 μl的细胞悬浮液转移至Collection Tube中。③ 加入0.8 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。2. 加入400 μl的Solution B，振荡混合。3. 加入1 ml的4℃预冷的Solution C，充分混匀后，12,000 rpm离心2分钟。4. 弃去上层有机相，再加入1 ml的4℃预冷的Solution C，充分混匀后，12,000 rpm离心2分钟。5. 弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中，12,000 rpm离心1分钟。注）有机相（上层）带有颜色，请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。相间沉淀不必考虑，在过滤时将被去除。6. 弃Filter Cup，在滤液中加入400 μl的DB Buffer，混合均匀。7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。8. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。9. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。注）请沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。10. 重复操作步骤9。11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。如果实验室备有适合于Spin Column接口的负压装置，可从上述操作步骤6完成以后进行以下操作。7. 将试剂盒中的Spin Column插到负压装置的插口上，将上述操作步骤6的混合溶液转移到Spin Column中，开启调节负压装置，缓慢吸走Spin Column中的溶液（流速控制在1滴/秒）。8. 将负压调至最大，向Spin Column中加入500 μl的Rinse A，吸尽Spin Column中溶液。9. 向Spin Column中加入700 μl的Rinse B，吸尽Spin Column中溶液。注）请沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。10. 重复操作步骤9。然后从负压装置上取下Spin Column，将其安置于试剂盒中的Collection Tube上，12, 000 rpm离心1分钟。11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
2015-02-03 22:12
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